Use of sodium dithiocarbamate as a biocide for Leuconostoc mesenteriodes in sugarcane factories. Part 7. Extraction of Metam Sodium in aqueous phase


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1 Uso del ditiocarbamato de sodio como agente biocida contra Leuconostoc mesenteroides en los ingenios azucareros. Parte 7. Extracción del metam de sodio de una fase acuosa Use of sodium dithiocarbamate as a biocide for Leuconostoc mesenteriodes in sugarcane factories. Part 7. Extraction of Metam Sodium in aqueous phase Tania Sofía Del-Río-Nava, Marisela Bernal-González, Carmen Durán-de-Bazúa 1 1 UNAM, Facultad de Química, Departamento de Ingeniería Química, Laboratorios 301, 302, 303. Laboratorios de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental, Ciudad de México. México Correos-e ( s): Resumen Uno de los mayores problemas en la industria azucarera es la pérdida de sacarosa durante el procesamiento de la caña de azúcar, que se relaciona con la formación de productos metabólicos no deseados atribuible a la actividad de la micoflora presente en la caña como el Leuconostoc mesenteroides principal microorganismo productor de dextranas. Para eliminar estas del proceso de producción de azúcar en los molinos (grinding mills), estrujadores (crushers) y en los sistemas de difusión, se ha utilizado el metam de sodio (MS), cuya materia activa es el N-metil ditiocarbamato de sodio, un plaguicida de la familia de los ditiocarbamatos (DTC), que posee actividad fungicida, insecticida, nematicida y herbicida. Para la cuantificación de residuos de plaguicidas en una matriz acuosa se han desarrollado varios métodos de preparación de la muestra, tales como extracción tipo Soxhlet, extracción en fase sólida (EFS), microextracción líquido-líquido, extracción sólidolíquido, extracción asistida por ultrasonido, así como por microondas y la microextracción en fase sólida. Estos métodos deben ser rápidos, fáciles, baratos, eficaces, resistentes y seguros. Por ello, en esta investigación se aplicó el método de EFS del plaguicida MS presente en el jugo de caña empleando como adsorbente un material de bajo costo: harina de cefalotórax y exoesqueleto de camarón y una fase comercial, octadecil-sílice C18(J.T. Baker ) como control. El objetivo de la investigación fue caracterizar, cuantificar y comparar por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC en inglés), la extracción en fase sólida (EFS) del MS presente en 1 ml de jugo de caña, utilizando como adsorbentes, harina de residuos de camarón entera y desmineralizada, además del control comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker ). El MS fue eluido con 3 ml de metanol:agua 60:40 y los porcentajes de recuperación obtenidos fueron 8.145±0.032, ±0.055 y ±0.037, para las harinas desmineralizada, harina entera y para el adsorbente comercial C18, respectivamente. Es importante continuar con los estudios con este material absorbente de bajo costo para mejorar su porcentaje de recuperación de MS. Palabras clave: Leuconostoc mesenteroides, metam de sodio (MS), extracción en fase sólida (EFS), octadecil-sílice C18, residuos de camarón secos, residuos de camarón desmineralizados Abstract One of the problems confronted in the sugarcane factories is the loss of sucrose during the process related to the formation of undesirable metabolic products attributed to the activity of the microbes present with sugar cane such as Leuconostoc mesenteroides. This microorganism is responsible for the production of dextrans from sucrose. To eliminate these microorganisms from the process in 1. XL Convención Nacional y Expo-ATAM Septiembre 12 al 14, WTC Boca del Río, Veracruz, México

2 the grinding mills and crushers and in the difusión systems, metam sodium (MS) is added. It active component is sodium N-methyl dithiocarbamate, a pesticide of the dithiocarbamates (DTC) family, possessing fungicide, insecticide, nematicide, and herbicide activity. For the quantification of pesticide residues in an aqueous matrix several analytical methods for sample preparation have been developed. Among them, the Soxhlet extractio, the solid phase extraction (SPE) and microextraction, the liquid-liquid microextraction, the solid-liquid extraction, the ultrasound assisted extraction, as well as using microwave energy, are the most common ones. These methods should be rapid, easy to handle, unexpensive, efficient, resistant, and safe. For this reason in this research the SPE method was applied to MS present in sugarcane juice using as adsorbent a low cost material from shrimp, cephalothorax and exoskeletons, transformed into powder, using a commercial phase, octadecyl-silica C18(J.T. Baker ) as control. The objective was to characterize, quantify, and compare by high performance liquid chromatography (HPLC), the solid phase extraction (SPE) of MS present in 1 ml of sugar cane juice, using as adsorbent materials, full ground shrimp residues and demineralized ones plus de commercial control. MS was eluted with 3 ml of a mixture methanol:water (60:40). Recovery percentages obtained were the following: 8.145±0.032, ±0.055, and ±0.037, for demineralized powder, full powder, and commercial adsorbent C18, respectively. Further studies should be conducted to improve the recovery percentages of MS with this low-cost adsorbent material. Keywords: Leuconostoc mesenteroides, metam sodium (MS), solid phase extraction (SPE), octadecyl-silica C18, dried shrimp residues, dsmineralized dried shrimp residues 1. Introducción La producción anual nacional de camarón en 2013 fue de toneladas, de acuerdo con SAGARPA-CONAPESCA (2014). De este total se generan de 20 a 35% de su masa total como residuos durante el proceso de limpieza del camarón, debido a que únicamente la parte abdominal de camarón es aprovechada como alimento. Estos residuos tienen una composición de 44.7% de proteína, 26.3% de cenizas, 20.7% de fibra cruda, 5.2% de grasa, y 3.1% de otros carbohidratos (Flores, 2004). De ellos se tiene un alto contenido de quitina (Fig.1), del 14 al 27% (Flores, 2004). La quitina es un polímero estructuralmente parecido a la celulosa, por lo que existe la posibilidad de utilizar las harinas obtenidas de los cefalotórax y exoesqueletos del camarón como adsorbente en la extracción en fase sólida de un plaguicida como el metam de sodio (MS), obteniendo porcentajes de recuperación similares a las columnas comerciales más utilizadas de octadecil-silice C18 (J.T. Baker ) (de-oliveira-arias et al., 2014). Fig. 1. Estructura de la quitina (Flores, 2008) Por ello, los objetivos de esta investigación fueron los de caracterizar, cuantificar y comparar por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la extracción en fase sólida (EFS) del MS presente en el jugo de caña, utilizando dos tipos de adsorbentes, la harina de cefalotórax y exoesqueleto de camarón entera y desmineralizada usando un control comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker ).

3 2. Materiales y métodos 2.1. Obtención de la harina de camarón A partir de los residuos de camarón adquiridos en la Central de Abastos La Nueva Viga de la Ciudad de México se obtuvieron los cefalotórax y exoesqueletos de camarón, los cuales se lavaron a chorro de agua y enjuagaron con agua destilada (Fig. 2). La muestra fue molida durante 5 minutos, por intervalos de 30 segundos. Posteriormente, se secaron en una estufa convencional a 60 ±5 C por 18 horas y se le dio una remolienda en licuadora y se separó con un tamiz del No. 100 para tener un material uniforme (Ramírez-Cruz et al., 2003; Bárcenas-Ochoa, 2010). Para obtener las harinas desmineralizadas, se utilizó EDTA 0.5 M, con agitación constante por dos horas, en una relación 1:9 (masa:volumen), se filtró con tela de seda y se enjuagó con agua destilada y desionizada. Fig. 2. Cefalotórax y exoesqueletos de camarón 2.2. Caracterización de la harina de camarón mediante los siguientes métodos -Determinación de humedad mediante una termobalanza (OHAUS MB200) (Kirk et al., 1996) -Materia grasa por el método de Soxhlet (James, 1999) -Determinación de cenizas por el método de calcinación utilizando una mufla FURNANCE 4800 T ( C) (Kirk et al., 1996) -Determinación de proteína por el método de Kjeldahl (Nielsen, 1998). -Determinación de fibra mediante método gravimétrico y enzimático (Kit de ensayo de fibra dietética de Sigma-Aldrich ) Cartuchos de extracción en fase sólida Con las harinas obtenidas (entera y desmineralizada) se empacaron 54 cartuchos (Fig. 3) de cada una de las harinas, en jeringas de plástico desechables (Sensimedical ) de capacidad de 5 ml, con una masa de 0.5 g de harina. Para ello se elaboraron tapones de fibra de vidrio previamente lavada con metanol grado HPLC, colocándolos en la base de la jeringa y en la parte superior del adsorbente (harina). Fig. 3. Cartucho de EFS (jeringas desechables comerciales), rellenado con harina de camarón seca entera o desmineralizada 2.4. Preparación de los estándares Se utilizó el MS (Analytical Standard 95% Sigma-Aldrich), realizando pruebas de estabilidad de la solución analítica (50 mg/l). Terminadas las pruebas se preparó una curva patrón según Lorenzo et al. (2014). Posteriormente, se realizó la validación de la curva patrón según lo establecidos en la guía de la Agencia para Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, FDA Draft Guidance, en inglés (Revicki, 2007).

4 2.5. Extracción del jugo de caña Para la extracción del plaguicida se consultaron diferentes artículos con la finalidad de encontrar un método que permitiera extraer al plaguicida de la matriz de jugo de caña (Gustaffson y Thompson, 1981; Gustaffson y Fahihrem, 1983; Mullins y Kirkbright, 1987; Stout et al., 1998; Hartmann et al., 2000; Bossi et al., 2003; Picó et al., 2004). Sin embargo; no se encontró en la bibliografía consultada una metodología para la extracción particular de este plaguicida por lo que se realizó la adaptación de un método de extracción de flavonoides presentes en jugo de caña (Colombo et al., 2006) complementándolo con otro método para la extracción de carbamatos de jugos de manzana, cereza y fresa (Sagratini et al., 2007). Se procedió a la extracción mecánica del jugo con la ayuda de un extractor de tipo casero usando caña almacenada en refrigeración, para realizar las pruebas correspondientes de un mismo lote Extracción en fase sólida (EFS) Los procedimientos de purificación por extracción en fase sólida se basan en el uso de dispositivos comerciales que contienen entre 50 y 1000 mg de un sólido poroso particulado, que generalmente es sílice o resinas poliméricas (polipropileno). En esta investigación se usaron harinas de cefalotórax y exoesqueleto de camarón, tanto enteras como desmineralizadas, usando como control los cartuchos comerciales de octadecil-sílice C18. El plaguicida MS se aisló de la matriz, extrayéndolo con un fluido adecuado y siguiendo la secuencia de la Fig. 4. Se tomaron 10 ml de las matrices de estudio: metanol, agua y muestra de jugo de caña, adicionadas con 10 ml de una dilución 30 mgl -1 del estándar analítico del plaguicida de estudio, MS (Sigma-Aldrich ) en metanol grado cromatográfico. Las muestras se sometieron a un baño sónico por 15 min. Posteriormente fueron centrifugadas por 15 minutos y los sobrenadantes se filtraron con una membrana de Nylon de 0.45µm. Finalmente, 3 ml de esta mezcla se hicieron pasar por los cartuchos de extracción con los diferentes adsorbentes (harina entera, harina desmineralizada y C18) previamente acondicionados con 5 ml de agua seguida de 5 ml de metanol. Para llevar a cabo la elución del compuesto de interés se utilizaron 1 ml, 3 ml y 5 ml de una mezcla de metanol/agua grado cromatográfico en diferentes proporciones. Las muestras eluídas se inyectaron en el HPLC por triplicado para su cuantificación. 1. Activar 2.Pasar 3. Lavar 4. Eluir 1. Activar el adsorbente con un disolvente adecuado; 2. Pasar la disolución que contiene los analitos de interés a través del adsorbente activado; 3. Lavar el adsorbente para permitir eliminar el mayor número de interferencias posibles; 4. Eluir los compuestos de interés mediante el paso del volumen necesario de una disolvente adecuado Fig. 4. Extracción en fase sólida (EFS) (Pawliszyn, 2002) 2.7. Cuantificación por CLAR (HPLC) Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución PerkinElmer y se realizó la adaptación de las condiciones establecidas por Arvizu-Bernal y Ramos-Medina (2011) para realizar la cuantificación de MS. En la Tabla 1 se presentan las condiciones empleadas.

5 Tabla 1. Condiciones establecidas para la cuantificación de Metam de sodio por HPLC Condición Arvizu-Bernal y Ramos-Medina (2011) Adaptación en este experimento Columna 100 mm x 4 mm Nucleosil RP mm x 4 mm Hypersil (5 µm) ODS C18 (5 µm) Fase móvil Agua/Acetonitrilo (50:50) Agua/Acetonitrilo (50:50) Velocidad de flujo 1.4 min min -1 Volumen de inyección 20 µl 20 µl Detector UV, 210 nm UV, 210 nm Tiempo de corrida 10 min 5 min 2.8. Curva de calibración de ditiocarbamato Se realizó una curva de calibración de 10 puntos con concentraciones que fueron de 0 a 50 mgl -1 de MS en metanol. Las disoluciones de cada concentración fueron preparadas en el momento de la inyección en el HPLC. Cada concentración se inyectó por triplicado y la concentración media (25 mgl -1 ) se inyectó 5 veces. 3. Resultados y discusión 3.1. Obtención de la harina de camarón La secuencia fotográfica muestra el harina obtenida a partir de los cefalotórax y exoesqueletos de camarón adquiridos gratuitamente en el local 26 de la Central de Abastos en la Ciudad de México La Nueva Viga (Figs. 5a,b). En la Fig. 6 se presenta una de las muestras de las harinas obtenidas después de la limpieza del cefalotórax del camarón, su secado, molienda y tamizado. Fig. 5a. Esquema del cuerpo de un camarón (Zavaleta, 2010) Fig. 5b. Residuos de camarón obtenidos después del descabezado de los camarones Fig. 6. Harina del cefalotórax de camarón 3.2. Desmineralización En seguida se procedió a desmineralizar la mitad de la harina obtenida agitando la harina con EDTA 0.5 M. Posteriormente, se filtró la mezcla de harina con EDTA en un matraz tipo Kitasato con tela de seda, obteniendo una harina húmeda después de la filtración. Finalmente, la harina seca desmineralizada se almacenó en el cuarto frío a 4±1 C Caracterización de la harina En la Tabla 2 se presentan los resultados de la determinación del porcentaje de humedad, porcentaje de cenizas por calcinación, porcentaje de grasa cruda, contenido de nitrógeno (proteína cruda), así como el contenido de fibra. Se observa que únicamente se pierden el 13.5% de los minerales en la harina desmineralizada tras el tratamiento con EDTA, con respecto a la harina

6 inicial. Se puede notar que la humedad es mayor en la harina entera, ya que a pesar de haberse introducido el mismo tiempo al horno los cefalotórax del camarón y la harina desmineralizada, esta harina tiene una mayor superficie de contacto, por lo que su secado fue mejor que la de los cefalotórax sin moler. Tabla 2. Caracterización de las harinas de camarón Determinación (%) Harina entera Harina desmineralizada Humedad 6.40 δ ± δ ± Cenizas δ ± δ ± Grasa cruda 0.31 δ ± δ ± Proteína δ ± δ ± Fibra δ ± δ ± Cuantificación de MS por HPLC Curva de calibración de MS. Con la regresión lineal se pudo comprobar la linealidad de la recta, indicada por el coeficiente de correlación de Del mismo modo, se obtuvo la ecuación de la recta, la cual sirve para calcular la concentración del ditiocarbamato de sodio (x) en la matriz de metanol. El coeficiente de variación (C.V.) para el punto medio fue de 5.92% indicando que hay poca variabilidad debida a la inyección de la muestra Porcentaje de recobro de MS Para poder analizar la recuperación del metam sodio después de realizadas las extracciones con los cartuchos de harina de camarón entera, el MS se cuantificó tanto en la disolución inicial, como en el producto eluido. Se realizaron las primeras eluciones con 3mL de eluyente y diferentes mezclas metanol/agua, en donde al realizar la elución de la muestra con un porcentaje de agua mayor al 40% se traslapaban los picos del metanol y MS, por lo que se decidió realizar las eluciones con la mezcla metanol/agua en proporción de 60:40, ya que con ellas se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación (Tabla 3). Tabla 3. Porcentaje de recuperación con diferentes mezclas metanol/agua Metanol: agua Recuperación MS (%) 100: δ ± : δ ± : δ ± : δ ± : δ ± El siguiente factor a considerar es el volumen de la disolución que se pasa por el cartucho. Para esto se probaron 3 volúmenes diferentes: 5, 3 y 1 ml. Se observó, que el mejor volumen para obtener la mayor extracción de los tres estudiados es de 1 ml. Una vez establecida la mejor mezcla para el eluyente y la cantidad de disolución que se debe pasar por el cartucho de extracción, se procedió a establecer la cantidad de eluyente necesario para recuperar todo el compuesto. Para ello se recuperaron las fracciones después de cada mililitro de eluyente, obteniendo los resultados mostrados en la Tabla 4. Tras realizar un análisis estadístico se determinó que no existe diferencia significativa entre las fracciones a partir de 3 ml, por lo que el volumen de elución seleccionado fue de 3 ml.

7 Tabla 4. Porcentaje de recuperación en las diferentes fracciones de producto eluido Fracción (ml) Recuperación en la fracción de MS (%) Recuperación total de MS (%) δ ± δ ± δ ± δ ± δ ± Por último, con las condiciones establecidas se procedió a probar la recuperación en los tres cartuchos (Fig. 7): con harina entera, con harina desmineralizada y usando los cartuchos comerciales C18. Al analizar los resultados de la Tabla 5, puede verse que existe diferencia significativa entre cada uno de ellos, sobre todo en el cartucho con harina desmineralizada. La desviación estándar que existe entre la harina entera y el producto comercial es de solamente el 7.84, es decir que se podría mejorar el proceso de empaquetamiento de los cartuchos para disminuir dicha diferencia. Fig. 7. Extracción en fase sólida con los cartuchos Tabla 5. Porcentaje de recuperación con diferentes cartuchos de EFS Cartucho Recuperación MS (%) Octadecil-sílice C18 (J.T. Baker ) δ ± Harina de camarón desmineralizada δ ± Harina de camarón entera δ ± Conclusiones Considerando los objetivos de esta investigación de caracterizar, cuantificar y comparar por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la extracción en fase sólida (EFS) del MS presente en el jugo de caña, utilizando dos tipos de adsorbentes, la harina de cefalotórax y exoesqueleto de camarón entera y desmineralizada usando un control comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker ) se tienen las siguientes conclusiones: Se observó que los resultados obtenidos en las determinaciones de humedad, ceniza, fibra, proteínas y grasa realizadas fueron similares con respecto a los resultados en otros estudios (Flores, 2004, 2008). Se realizó de manera experimental la optimización del método de extracción en fase sólida. Al observar si había diferencias significativas al variar los parámetros, con los resultados obtenidos, se concluye que las mejores condiciones de extracción para este biocida en los cartuchos son las siguientes: eluyente: metanol/agua (60:40), volumen de eluyente: 1 ml y volumen de muestra: 1 ml.

8 Tras cuantificar el MS extraído, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, se pudo determinar que sí hubieron diferencias significativas debidas al origen del adsorbente en la extracción en fase sólida (EFS) del MS presentando un coeficiente de variación de Se obtuvo el mejor porcentaje de recuperación con la columna comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker ) con un porcentaje de δ ± 0.037, seguida de las columnas de harina de camarón entera con un porcentaje de δ ± y, por último, con el menor porcentaje de recuperación de δ ± 0.032, las columnas que tienen como adsorbente la harina de camarón desmineralizada. Esto indica que las condiciones estudiadas en esta fase de la investigación pueden ser mejoradas con objeto de que el desempeño del material de bajo costo sea comparable con el comercial. La desmineralización definitivamente altera las características químicas del polímero natural obtenido de los residuos de camarón por lo que deberá estudiarse esto con mayor profundidad desde el punto de vista químico. Reconocimientos Los autores agradecen a la UNAM a través de su Dirección General de Asuntos del Personal Académico por la beca otorgada a la primera autora para la culminación de sus estudios de licenciatura mediante el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) dentro del proyecto con clave IN102214, así como por el financiamiento parcial para realizar esta investigación con el mismo proyecto y a la Facultad de Química a través del Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado de la última autora. El equipo Büchi para realizar los análisis de nitrógeno (proteína) fue donado por la Oficina de Intercambio Académico Alemana, DAAD, por sus siglas en alemán a través de la cooperación académica con el Dr. Peter Kuschk del Centro Helmholtz de Investigaciones Ambientales de Leipzig, UFZ, en alemán. Bibliografía Arvizu-Bernal, D. I., Ramos-Medina, J. C. (2011). Degradación del ditiocarbamato de sodio usado como plaguicida en el proceso de elaboración de azúcar en México mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR). Tesis profesional de Química de Alimentos. Facultad de Química, UNAM. Defensa: Diciembre 2. México D.F., México. Bárcenas-Ochoa, E. M. (2010). Biopolímeros de cefalotórax y exoesqueleto del camarón. Uso de aditivos para modificar sus propiedades mecánicas. Tesis profesional de Química de Alimentos. Facultad de Química, UNAM. Defensa: Agosto 23. México D.F., México. Bossi, R., Vejrup, K. V., Mogensen, B. B., Asman, W. A. H. (2002). Analysis of polar pesticides in rainwater in Denmark by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 957(1), Colombo, R., Lanças, F. M., Yariwake, J. H. (2006). Determination of flavonoids in cultivated sugarcane leaves, bagasse, juice and in transgenic sugarcane by liquid chromatography-uv detection. Journal of Chromatography A. 1103(1), de-oliveira-arias, J. L., Rombaldi, C., Caldas, S. S., Primel, E. G. (2014). Alternative sorbents for the dispersive solid-phase extraction step in quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for extraction of pesticides from rice paddy soils with determination by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1360, Flores, R. A. (2004). Bioplástico de quitina: Formación de películas de quitina a partir de desechos de camarón por métodos ecológicos. Tesis de Maestría en Ciencias. Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Químicas, Facultad de Química, UNAM. Defensa: Agosto 20. México D.F., México. Flores, R. A. (2008). Obtención y caracterización de esponja de quitina a partir de cefalotórax de camarón. Tesis de Doctorado en Ciencias. Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Químicas, Facultad de Química, UNAM. Defensa: Abril 25. México D.F., México.

9 Gustafsson, K. H., Fahlgren, C. H. (1983). Determination of dithiocarbamate fungicides in vegetable food stuffs by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31(2), Gustafsson, K. H., Thompson, R. A. (1981). High-pressure liquid chromatographic determination of fungicidal dithiocarbamates. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 29(4), Hartmann, H., Burhenne, J., Müller, K., Frede, H. G., Spiteller, M. (2000). Rapid target analysis for pesticides in water by online coated capillary microextraction combined with liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Journal of AOAC International. 83(3), James, C. S Analytical Chemistry of Foods. Second Edition, ASPEN Publishers. New York, EE.UU. Kirk, R.S., Sawyer, R. Egan, H Composición y análisis de alimentos. Pearson. Segunda edición. Editorial CECSA. México D.F., México. Lorenzo, C., Serrano-Díaz, J., Plaza, M., Quintanilla, C., Alonso, G. L. (2014). Fast methodology of analysing major steviol glycosides from Stevia rebaudiana leaves. Food Chemistry. 157, Mullins, F. G., Kirkbright, G. F. (1987). Determination of sodium N-methyldithiocarbamate (metham sodium) and methyl isothiocyanate in aqueous samples by high-performance liquid chromatography using a micellar mobile phase. Analyst. 112(5), Nielsen, S Food Analysis. Second Edition. Aspen Publication, pp Gaithersburg, EE.UU. Pawliszyn, J. (2002). Sampling and sample preparation for field and laboratory: Fundamentals and new directions in sample preparation. Elsevier. 37, Picó, Y., Blasco, C., Font, G. (2004). Environmental and food applications of LC tandem mass spectrometry in pesticide-residue analysis. An overview. Mass Spectrometry Reviews. 23(1), Ramírez-Cruz, M. A., García-Gómez, R. S., Flores-Argüello, I., Gálvez-Mariscal, A., Durán-de- Bazúa, C. (2003). Empleo de una enzima quitinolítica de Serratia marcescens para la obtención de carotenoproteínas a partir del cefalotórax de camarón. Tecnología, Ciencia, Educación (IMIQ, Mex). 18(1), Revicki, D. A. (2007). FDA draft guidance and health-outcomes research. The Lancet. 369(9561), SAGARPA-CONAPESCA Anuario estadístico de pesca pp. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca, México. [En línea]. Disponible en: [Último acceso 27 de septiembre de 2016]. Sagratini, G., Manes, J., Giardiná, D., Damiani, P., Picó, Y. (2007). Analysis of carbamate and phenylurea pesticide residues in fruit juices by solid-phase microextraction and liquid chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147(2), Stout, S. J., Dacunha, A. R., Picard, G. L., Safarpour, M. M. (1998). Simplification of analytical methods in pesticide residue analysis by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Journal of AOAC International. 81(4), Zavaleta, M. E. F. (2010). Extracción de astaxantina a partir de residuos de camarón ensilados por métodos ácido y bacteriano. México D.F.: Tesis de Doctorado, Division de Ciencias Biológicas y de la Salud, Unidad Iztapalapa, Universidad Autónoma Metropolitana. Ciudad de México. México.